欢迎访问盐城苏力涂装工程有限公司专业从事涂装设备的研发设计生产及营销

博客 微博 微信 设为首页 | 加入收藏 | English
7×24H 全国统一服务电话: 400-853-7885
市场咨询: 0515-88666088 应急热线: 0515-88666188
江苏苏力机械股份有限公司
联系我们

江苏苏力机械股份有限公司


免费热线:400-853-7885

联系电话:13921821999

               13905102888

服务热线:0515-88666188

               0515-88666088

传      真:0515-88662558

邮      箱:chinasuli@vip.163.com

生产基地:江苏省盐城市楼王镇

              盐金路

咨询热线:400-853-7885 0515-88666188/88666088

毛细管电泳分析多肽研究进展

日期时间:2018-05-21 14:33 文章来源:江苏苏力机械股份有限公司浏览次数:

毛细管电泳是一种分离效率高、灵敏度高并且样品用量少的分析技术。这里综述了毛细管电泳 技术在多肽分析中的应用,以及毛细管电泳技术与其他技术联用分析多肽的研究进展,并展望了其发展趋势。
  毛细管电泳技术发展于20世纪80年代,由于 其具有操作简单、样品和缓冲液用量少、分离快速 高效、有多种分离模式等优点,很快成为一种常用 的分离手段。可以用于分析无机离子、小分子、氨 基酸、多肽和蛋白质,甚至是单细胞水平的分析,广 泛应用于药物 、生命科学 、环境 等领域。 在过去的几十年中,科学家不断的对毛细管电泳技 术进行研究,促使毛细管电泳技术得到快速发展。 现如今,毛细管电泳技术已经成为分析多肽最有吸 引力的工具之一 。
1 毛细管电泳
毛细管电泳又高效 毛细管电泳(hpce),是指以高压电场为驱动力,以 毛细管为分离通道,依据样品中各个组分在毛细管 中分配行为和淌度的差异而进行高效、快速分离的 一种新型的液相分离分析。
为满足对不同类型多肽分析的需求,科学家研 发出多种毛细管电泳分离模式,推动的毛细管电泳 技术的不断发展和完善。毛细管电泳技术主要有: 毛细管凝胶电泳、毛细管区带电泳、毛细管胶束电 动色谱、毛细管等速电泳、毛细管电色谱、亲和毛细 管电泳、非水毛细管电泳、毛细管阵列电泳、芯片毛 细管电泳等。有些毛细管电泳还可以与其他分析 方法联用,例如;毛细管电泳-二极管阵列 、毛细管 电泳-液相色谱、毛细管电泳-质谱、毛细管电泳-化 学发光等 。
2 毛细管电泳在多肽分析中的应用
2.1 多肽的分离
随着分析技术的不断发展和完善,涌现出很多 分离分析手段。毛细管电泳技术发展较为迅速,应 用领域广泛,常用于多肽分离。薛洪宝等 利用毛 细管电泳建立了一种简单、快捷、高效的分析方法, 并利用此法分离了15种氨基酸和2种多肽,获得了 令人满意的实验结果。程燕等[10]通过毛细管电泳 技术分离了16种二肽,并研究了缓冲液浓度及ph 值对二肽衍生物分离的影响。在最优的实验条件 下,实现了14min内成功分离16种cec二肽衍 生物。
2.2 多肽的纯度鉴定
对于测定多肽的纯度常用的方法是hpc法, 此方法可能存在分析时间长,分离效果不佳,成本 昂贵等局限,因此很有必要开发其他方法对多肽纯 度鉴定。宫菲菲等利用毛细管区带电泳(ce) 方法测定艾塞那肽纯度,并初步考查其稳定性。其 纯度测定结果与高效液相色谱法基本一致,但此法 的分离效果更好,分析时间短。kang等 用聚二 甲基丙烯酸酰胺动态涂层修饰毛细管,结合p和 短端进样等技术快速测定了叶酸对应体的纯度。
2.3 多肽的性质研究
毛细管电泳对多肽性质的研究主要集中在分 子量测定、稳定性研究以及多肽的结构分析。 刘静等采用毛细管电泳发测定了水解后大 豆多肽的分子量,结果表明,所制样品分子量主要 分布在8200da以下。廖海明等以葡萄糖为分离 介质,测定了15种蛋白质分子量,其测定结果与平 板sds-聚丙烯酰胺胶电泳(sds-page)测定的结 果基本一致。
测定多肽组分的方法主要有:高效液相色谱 法、质谱、电泳和核磁共振等。最常用的是反相高 效液相色谱法,但是此法却存在一定的弊端:对相 对分子质量较小的多肽分离效果不太理想。毛细 管电泳技术具有其他分析方法不具备的优势,例如 分析周期短、分离方式多样等。王辰等]利用高效 毛细管电泳法研究了脑蛋白水解产物中的多肽组 分,并测定了进口脑蛋白水解产物注射液的多肽组 分分布。以溶菌酶(相对分子质量为14400)和胰岛 素(相对分子质量为6000)为标记物,两者间的峰为 多肽,进口脑活素注射液中所含组分多数集中在> 14400区域,“强脑素”所含多肽的相对分子质量大 部分集中在6000~14400之间。
利用hpce分离分析多肽,可以得到多肽的结 构信息。李峰等通过高效毛细管法得到了蜈蚣 药材的“指纹图谱”,鉴别了蜈蚣药材商品的种类, 对其质量进行控制。
3 毛细管电泳与其他技术联用分析多肽
随着当今科技的快速发展,多种分析技术联用 的优点已逐渐被人们意识到,比如高效液相色谱-质 谱法联用技术。随后,基于毛细管电泳技术与其 他联用技术联用的技术相继被开发出来。人们对 于毛细管电泳技术的研究日益深入,涌现出一些其 他可使用的检测器,例如激光诱导荧光检测器,二 极管阵列检测器等。但是这些检测器或多或少存 在一些不足。例如在利用毛细管电泳分析多肽类 药物时,由于多肽类药物杂质的结构与多肽的结构 非常相近,如果采用单一的分析方法,很难得到满 意的结果。因此,采取两种及两种以上分析原理成 为发展趋势。近些年国内外者研究了毛细管电泳 技术与其他技术联用分析多肽,并且得到了令人满 意的结果。
3.1 毛细管电泳-质谱
高分离效率的毛细管电泳与具有优越结构定 性能力的质谱结合,形成ce-ms联用技术,此技术 已经可以与hplc-ms技术媲美。特别是近几年 质谱技术的快速发展,尤其是灵敏度的提高,很大 程度上改善了由于ce进样量小导致检测灵敏度较 低的缺点。但ce-ms联用技术在实际的运用中依 然存在很大的挑战,把ce 与ms 联用要比把 hpLc与ms联用困难得多。因为ce一端插入缓 冲液中,而另一端要跟质谱相连。ce的工作必须 有闭合回路,形成高压电场。这就要求ce和ms 之间不仅要有良好的接触,更要有高效的离子化效 率。而hpLc与ms可以通过分流技术,使流出色 谱柱的流动相直接与质谱仪相连,离子化之后检 测,二者之间不需要电的接触
ce-ms联用技术能对多肽杂质进行结构鉴定, 是表征多肽杂质的一种非常重要的分析手段。 hoitink等[21]利用ce-ms法分析了戈舍瑞林在碱 性条件(ph=9)、酸性条件(ph=5)下降解产物的   同时 还做了ce-ms与Lc-ms的对比,结果发现ce-ms 对缺失肽有较好的分离效果。Yu 等[2 3] 利用 hpLc/eSI-ms/ms技术测定了单细胞中的谷光甘 肽。cha等[2 4]采用毛细管柱-电喷雾质谱成功鉴定 了宫颈癌中的237个肽段和163个蛋白质。Rittgen 等[25]用ce-ms分析了Amanita菌毒性多肽。 ce-ms联用的关键因素是接口技术,有离线联用和 在线联用两种模式。ce-ms在线联用具有更智能 且样品损耗少的优点,被广泛研究。Nguyen等[26] 开发了一种新型的ce-ms技术,该技术采用无鞘 液接口,他们证实此技术可有效的用于复杂混合多 肽的分析。
ce-ms联用技术用于多肽研究的发展趋势,主 要取决于ce分析能力的提高以及更高效更灵敏新 型接口的开发。发展毛细管涂层技术,减少毛细管 壁对多肽的非特异性吸附可以有效的提高ce的分 析能力;另一方面要开发各种模式的接口,以满足 ce-ms技术的发展需求,当今常用的接口技术主要 是自对准负压混合液的电喷雾接口和无保套的金 属鲁棒性和高灵敏度的样品定量涂布发射器接 口,这些接口技术远远不能满足ce-ms联用技 术的发展需求,这也是现阶段限制ce-ms联用技 术发展的因素。因此,开发更多接口技术对ce-ms 联用技术的发展有重大的意义。
3.2 毛细管电泳-色谱
毛细管凝胶电泳是基于分子筛原理进行多肽 的分离。但是此方法在分离多肽时存在一些不足, 例如一次性处理样品的量少,并且不能进行大量的 样品收集制备。为了克服这些不足,Dominguez 等[28]等将毛细管电泳技术与hpLc技术联用,用 于测试capillary-hpLc列和优化分离条件,此方法 提高了大豆多肽的分离效率,为快速分离纯化不同 大豆食品中的多肽提供了方法。叶淋泉等探索 了液滴接口二维分离技术,他们以液滴作为接口连 接高效液相色谱与毛细管电泳,分析了蛋白质降解 的多肽混合物,获得了大于3000的峰容量,丰富了 毛细管电泳-色谱联用技术形式,扩展了此技术的应 用领域。
3.3 毛细管电泳-化学发光
化学发光法是公认比较灵敏的检测技术[30]。 它是根据被测物质在特定条件下化学发光强度的 不同来定量分析的技术。相比于其他光学检测方 法,化学发光法不受来自光源杂散光的干扰,很容 易获得较低的检测噪声。将高分离效率的毛细管 电泳技术与高灵敏度的化学发光法联用形成毛细 管电泳-化学发光法(ce-cL)。ce-cL具有背景信 号地,检测灵敏;有较宽的线性范围简单,可实现定 性分析,广泛应用于多肽、氨基酸及药物等领域[31]。 ce-cL技术的关键在于cL试剂的引入和检测界面 的构建。ce-cL 常用的接口检测模式是柱检测 模式
苏孙煌[34]研制了“毛细管电泳-电致化学发光 检测器”,该检测器采用的分离检测对象为Luminol- NaOh,通过实验证明该检测器检测具有较高的 灵敏度及较好的重现性,可实现对多肽的快速分离 与检测。Zhou等通过ce-cL联用技术,氧化石 墨烯作为载体,检测了病人血清中的癌胚抗原,检 出限为4.8pgmL-1。此方法解决了在测试过程中 对样品信号的干扰问题,很大程度上提高了检测灵 敏度和精度。Zhao等利用Mce-cL方法检测 了红细胞内谷胱甘肽的含量,其检出限为5×10-20 mol。此方法比激光诱导荧光法检测红细胞内谷胱 甘肽含量的方法操作更加简单,灵敏度提高显著。 毛细管电泳存在蛋白质特异性吸附问题,Liu等 开发了一种动态涂层的ce-cL检测系统,解决了蛋 白质特异性吸附的问题。聚吡咯烷酮粘度低易溶 于水,很容易进入毛细管并覆于毛细管的内壁。实 验结果显示,采用聚吡咯烷酮以后,蛋白质特异性 吸附现象明显减弱,且此方法具有较好的重复性。 ce-cL联用技术兼具高灵敏度和高分离效率 的特点,已成为一种高效的分离检测多肽的方法。 然而ce-cL联用技术在多肽的分离检测方面重现 性不太稳定,因为此技术不仅对毛细管电泳技术有 较高的要求,它还受到化学发光反应物流速、反应 物混合模式以及反应类型的影响。ce-cL联用技 术线性范围大约只有两个数量级,目前cL标记 技术也不成熟,这就限制了ce-cL联用技术的发 展。在未来几年,ce-cL联用技术在多肽分析方面 的应用还需在以下方面深入研究:(1)开发新型cecL 联用仪器接口,提高系统的选择性、稳定性和灵   敏度;
(2)ce-cL联用技术可以和色谱、质谱等方法 联用,以获得更好的性能;(3)扩展ce-cL联用技术 的检测范围。
3.4 毛细管电泳-激光诱导荧光检测法 激光诱导荧光检测器(LIF)运用于毛细管电泳 技术,对毛细管电泳技术的发展具有里程碑意义。 激光诱导荧光检测器的引用,打破了毛细管电泳检 测灵敏度不高的限制,使检测分析灵敏度提升了3 ~4个数量级[39],一般情况下LIF的检出限比普通 的UV法低很多,并且在一定条件下还可以实现单 个细胞的检测。因此,ce-LIF联用技术在生物分 析中具有很大的应用前景
王宇飞等用毛细 管电泳-激光诱导荧光直接检测氧化型和还原型谷 胱甘肽及其构成氨基酸。在此之前检测谷胱甘肽 的方法有很多,但是能够同时检测其构成氨基酸的 方法较少。他们的方法能够快速的实现基线分离, 并且具有检测线低的优势。唐敏等利用激光诱 导荧光检测微流控芯片毛细管电泳技术分离了牛 血清蛋白的胰蛋白酶酶解产物,并分析了多种影响 电泳分离性能的因素,如缓冲液组成、表面活性剂 浓度等,确定了最优实验条件,取得了良好的实验 结果。

毛细管电泳技术用于多肽研究的发展方向仍 然是提高多肽分析的分辨率和速率。为了满足生 命科学研究日新月异发展的要求,应将毛细管电泳 技术与其他分析技术更好地结合,继承各自的优 点,摒弃各自的缺点,可以实现更快速、更准确的分 析多肽,同时也能拓宽毛细管电泳的应用领域。